2000 - 2001
D.E.A. "Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques"
Mémoire bibliographique
UCB - Lyon 1 ; INSA de Lyon ; ENGREF
École Doctorale E2M2
Introduction
1. Matériel et méthodes
1.1 Terminologie et définition
1.2 Matériel biologique
1.2.1 Le black-bass
1.2.1.1 Position systématique
1.2.1.2 Conditions d'élevage au laboratoire
1.2.1.3 Les rythmes biologiques chez le black-bass
1.2.2 L’hypophyse
1.2.2.1 L’adénohypophyse
1.2.2.2 La neurohypophyse
1.3 Méthodes histologiques
1.3.1 Préparation des échantillons
1.3.2 Technique d’hybridation in situ
1.3.2.1 Principe de l'hybridation in situ
1.3.2.2 Mise au point des sondes oligonucléotidiques
1.3.2.3 Protocole d'hybridation in situ
1.4 Histométrie
1.4.1 Numérisation
1.4.2 Amélioration des images
1.4.3 Mesures
1.4.4 Automatisation des mesures
1.5 Analyse statistique
1.5.1 Plan expérimental
1.5.1.1 Etude préliminaire
1.5.1.2 Echantillonnage temporel
1.5.1.3 Variable mesurée
1.5.2 Statistiques inférentielles
1.5.2.1 Questions d’intérêts
1.5.2.2 Test t de Student
1.5.2.3 Analyse de la variance
2 Résultats
2.1 Mise en éviden ce des ARNm codant pour les récepteurs à mélatonine au sein de l’hypophyse de black-bass
2.1.1 Validation du protocole expérimentale
2.1.2 Homogénéité du marquage anti-sens au sein de l’hypophyse
2.1.3 Spécificité du signal anti-sens
2.1.4 Localisation des ARNm mt1
2.1.5 Caractérisation du signal non spécifique
2.2 Variations nycthémérales des ARNm mt1
3 Discussion et perspectives
Références bibliographiques
Annexes
Chez les Poissons Téléostéens, de nombreux rythmes biologiques ont été décrits dans les domaines circadiens et annuels. Ces rythmes concernent les activités comportementales telles que la locomotion et la prise alimentaire, mais aussi les sécrétions hormonales. Que ce soit pour les rythmes comportementaux ou physiologiques, la lumière est reconnue comme un des principaux facteurs de synchronisation. Chez les Mammifères, au niveau interne, l’effet synchroniseur de la lumière est relayé par la mélatonine, hormone sécrétée par la glande pinéale. Chez les Poissons, le rôle de cette hormone dans l’expression des rythmes comportementaux ou physiologiques n’est pas clairement défini. Toutefois son action est établie dans la fonction de reproduction.
La mélatonine agit sur des cellules cibles via des récepteurs membranaires. Ces derniers ont été retrouvés dans le système nerveux central. En ce qui concerne l’hypophyse, organe important dans les régulations physiologiques, la présence de récepteurs est en cours d'étude. Chez le poisson rouge et le brochet, Iigot et al. (1994) et Gaildrat et Falcon (2000) respectivement ont mis en évidence des récepteurs à mélatonine. Chez la truite, les études de Mazurais (2000) indiquent que la quantité de ces récepteurs est très faible et leur mise en évidence dépend de la sensibilité de la technique utilisée. Chez le black-bass, nous avons recherché les récepteurs à mélatonine de type mt1 avec une méthode différente. Précisément, nous cherchons à localiser les ARNm codant pour ces récepteurs dans l’hypophyse par la technique d’hybridation in situ. Dans un deuxième temps, nous avons abordé les variations de densité en ARNm au cours d’un cycle de 24 heures en condition d’alternance lumière/obscurité (LD 12:12). Cette étude s’intègre dans un programme plus large de l’étude de l’effet de la mélatonine sur l’axe hypothalamo-hypophysaire en relation avec la croissance et le comportement de prise alimentaire du poisson.
Après un bref rappel sur les rythmes nous décrirons le matériel et méthodes, en particulier la méthode d’histométrie que nous avons mis au point. Les résultats présentés dans un deuxième temps seront examinés lors d'une discussion finale. Bien que six prélèvements soient effectués régulièrement sur un nycthémère, seuls quatre horaires ont pu être traités.
Lorsqu’un rythme biologique persiste en conditions constantes (DD ou LL), on dit que ce rythme possède une composante endogène. Le rythme observé est alors dit en libre cours et sa période est qualifiée de propre. Dire d’un rythme qu’il possède une composante endogène revient à dire qu’il existe au sein de l’organisme un mécanisme de repérage du temps. Ce mécanisme est appelé horloge biologique.
La localisation de l'horloge varie en fonction du groupe animal. Chez les Vertébrés mammaliens, les noyaux suprachiasmatiques situés dans l'hypothalamus abritent une horloge maîtresse (Ralph et al., 1990). Chez les Poissons, les Amphibiens et certains Oiseaux, la glande pinéale joue ce rôle (Gaston et Menaker, 1968). Le rythme circadien de libération de mélatonine par cette glande est notamment en rapport avec les rythmes d'activité locomotrice.
L’alternance lumière-obscurité est unanimement reconnue comme le principal facteur entraînant les rythmes circadiens. L'entraînement se caractérise par le fait que le cycle lumineux impose sa période au rythme biologique (Boissin et Canguilhem, 1998).
Notre étude portant sur les récepteurs à mélatonine au sein de l’hypophyse, il convient de rappeler la structure et la fonction de cet organe.
Figure 1 : Organisation générale de l’encéphale de truite
(d’après Meek et Nieuwenhuys, 1998).
Figure 2 : représentation schématique de l’hypophyse chez la perche
(d’après Pickford et Atz, 1957 ; Takashina et Hibiya, 1995)
1 : pro-adénohypophyse ; 2 : méso-adénohypophyse ; 3 : méta-adénohypophyse ; 4 : neurohypophyse
L'adénohypophyse est sous divisée en trois régions : la pro-adénohypophyse ou rostral pars distalis, la méso-adénohypophyse ou proximal pars distalis et la méta-adénohypophyse ou pars intermedia (figure 2).
Les animaux sont sacrifiés à l’aide d’une dose mortelle de MS 222 dilué dans l’eau. Ils sont décapités puis le crâne est décalotté. Immédiatement du fixateur (paraformaldéhyde à 4% dans du tampon PO4, 100mM) est injecté sous le cerveau pour fixer l’hypophyse. L’encéphale est alors retourné et l’hypophyse prélevée et plongée dans le fixateur.
L’hypophyse est laissée pendant trois heures dans le fixateur puis placée dans de l’éthanol 70°. Entre la décapitation et l’immersion dans le fixateur, il se déroule moins d’une minute. L’organe est déshydraté dans des bains d’éthanol puis inclus dans de la paraffine (Martoja et Martoja, 1967). Lors de l’inclusion, nous orientons l’hypophyse pour obtenir des coupes comparables d’un individu à un autre. On réalise ensuite des coupes de 7µm d’épaisseur grâce à un microtome Leitz 1515. Ces coupes sont collées sur des lames silanisées (3-Amino-Propyl-tri-Ethoxy-Silane). Après séchage durant 24 heures dans une étuve à 37°C, les coupes sont traitées par hybridation in situ.
Figure 3 : Principe de la révélation en Hybridation in situ avec marqueur antigénique (d’après Morel et Cavalier, 1998)
A : la sonde s’hybride avec la cible. B : une streptavidine couplée à la péroxydase se fixe sur la biotine de la sonde. C : l’adjonction d’un réactif incolore (DAB) donne un précipité coloré en présence de l’enzyme.
Nous avons recherché dans la banque de gènes Genbank les séquences complètes codant pour les ARNm des récepteurs à mélatonine de type mt1. Les 20 séquences obtenues concernent des Vertébrés, avec 2 sources chez l’homme et le mouton.
L'alignement multiple de ces séquences à l’aide du programme Macaw révèle un fort taux d’homologie, de l’ordre de 70% en moyenne (figure 4).
Figure 4 : Alignement multiple des séquences codant pour l’ARNm des récepteurs à mélatonine de type mt1.
Séquence de l’ARNm de : a : Homme ; b : Mus musculus ; c : Oncorhynchus mykiss ; d : Mesocricetus auratus ; e : Phodopus sungorus ; f : Ovis aries ; g : Gallus gallus ; h : Oryctolagus cunuculus ; h : Rattus norvegicus.
Dans les zones de forte homologie (en bleu sur la figure 4), une séquence spécifique des récepteurs de type mt1 a été recherchée, l’objectif étant d’obtenir une séquence ne pouvant s’hybrider qu’avec les ARNm mt1. La suite de 29 nucléotides (nt) : 5' - TAA CTA GCC ACG AAC AGC CAC TCG GGG AT - 3' répond à ce critère. Confrontée grâce au logiciel Blast aux banques Genbank, EMBL (European Molecular Biology Laboratory) et DDBJ (DNA Data Bank of Japan), cette suite s’hybride virtuellement à 19 séquences, dont 15 codent pour des récepteurs à mélatonine de type mt1 et 4 pour des séquences bactériennes ou virales (tableau I). Le pourcentage d’hybridation est de l’ordre de 80% pour les 9 premières séquences et la longueur des hybrides est d’au moins 19 paires de bases sans interruption.
Tableau I : Résultats de l’hybridation virtuelle de la sonde avec le logiciel Blast.
Expect est la valeur attendue lors d’une recherche au
hasard, elle décroît exponentiellement avec le score. La valeur par défaut est 10.
Score | Expect | |
Mus musculus melatonin receptor 1A (Mtnr1a), mRNA | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Phodopus sungorus melatonin receptor Mel-1a mRNA, complete cds | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Mesocricetus auratus melatonin receptor Mel1a mRNA, partial cds | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Ovis aries Mel 1a melatonin receptor mRNA, complete cds | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Ovis aries Mel-1a melatonin receptor mRNA, complete cds | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Mus musculus Mel-1a melatonin receptor mRNA, complete cds | 50.1 bits (25) | 3,00E-05 |
Rattus norvegicus melatonin receptor (MT1) mRNA, partial cds | 42.1 bits (21) | 0.008 |
Rattus norvegicus melatonin receptor mRNA, partial cds | 42.1 bits (21) | 0.008 |
Oncorhynchus mykiss melatonin receptor Mel1a mRNA, complete cds | 38.2 bits (19) | 0.13 |
Oncorhynchus mykiss melatonin receptor gene, partial cds | 36.2 bits (18) | 0.50 |
Homo sapiens melatonin receptor 1A (MTNR1A), mRNA | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Homo sapiens melatonin receptor 1A (MTNR1A), mRNA | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Nectria haematococca kinesin related protein 1 (KRP1) gene, complete cds | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Bos taurus melatonin receptor 1a (MTNR1A) gene, partial cds | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Human Mel-1a melatonin receptor mRNA, complete cds | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Homo sapiens hMel1a gene for melatonin 1a receptor, exon2, complete cds | 34.2 bits (17) | 2.0 |
Halobacterium sp. NRC-1 section 6 of 170 of the complete genome | 32.2 bits (16) | 7.8 |
Pseudomonas phage D3, complete genome | 32.2 bits (16) | 7.8 |
Bacteriophage D3, complete genome | 32.2 bits (16) | 7.8 |
Deux oligonucléotides biotinylés ont été fabriqués sur commande par CyberGene, la suite de 29 nt appelée sonde anti-sens et la sonde sens : 5'- ATC CCC GAG TGG CTG TTC GTG GCT AGT TA -3'. Cette dernière permet d’apprécier le taux d’hybridation non spécifique.
Après déparaffinage et hydratation, nous effectuons une déprotéinisation des acides nucléiques. L'hybridation est effectuée pendant trois heures à température ambiante avec d'une part la sonde anti-sens et d'autre part la sonde sens. Après lavage et inhibition des péroxydases endogènes, les hybrides sont révélés avec le Diaminobenzidine (DAB) puis les coupes sont déshydratées et montées sous Depex. Le protocole est détaillé en annexe 1.
Le résultat de la réaction enzymatique est un produit de couleur brune. Pour déterminer le bruit de fond lié à l’utilisation de ce substrat, certaines coupes sont traitées avec le seul tampon d’hybridation (sans sonde).
Figure 5 : Traitement des images sous Photoshop.
Figure 6 : Elimination de l'artéfact.
Dans un premier temps nous séparons les trois couches colorimétriques rouge, verte et bleue. Nous conservons la couche la plus contrastée. Dans notre cas, il s’agit de la couche bleue (figure 7). Cette couche conserve l'information de niveau de gris : plus une zone de la coupe est marquée, plus elle apparaît gris foncé. L'échelle des gris s'étend de 0 (blanc) à 255 (noir).
Figure 7 : Composition colorimétrique des images.
Figure 8 : Seuillage avec Image.
Tout d’abord, nous avons cherché à vérifier l’homogénéité du marquage tout au long de l’hypophyse, de manière à pouvoir éventuellement limiter le nombre de coupes à traiter.
Ensuite, nous avons cherché à caractériser le signal non spécifique (sonde sens). Si ce signal est variable à l’intérieur de l’organe, il faut déduire ce marquage à celui obtenu avec la sonde anti-sens, ce qui entraîne des difficultés supplémentaires dans l’analyse d’images. Si le signal non spécifique est constant, soit on procède comme précédemment, soit on n’en tient pas compte pour l’analyse. Nous privilégierons la deuxième option, du fait que nous ne voulons pas effectuer une quantification absolue mais seulement relative.
Pour prendre la variabilité inter-individuelle en compte, nous avons effectué quatre prélèvements par horaire. Signalons que les animaux sont prélevés au hasard dans les viviers. Les échantillons sont indépendants car les individus sont sacrifiés et ne sont utilisés que pour un seul horaire.
Pour s’affranchir de ces variations, nous avons rapporté la surface marquée (Sm) à la surface totale (St) de la coupe, le rapport obtenu (Sm/St) constitue la variable étudiée (Larson et al., 1991).
Pour répondre à la question de l’effet de l’éclairement (jour/nuit) sur le taux d’ARNm de type mt1, nous avons utilisé un test t de Student sur échantillons non appariés.
Nous rappellerons simplement ci-dessous les conditions d’application du test et le degré de robustesse associé.
Les contraintes majeures restreignant l’utilisation de l’ANOVA sont au nombre de trois : indépendance des échantillons, normalité des populations et égalité des variances des groupes soumis à l’analyse.
Comme nous l’avons rappelé au paragraphe plan expérimental (1.5.1.), les échantillons sont indépendants étant donné qu’une hypophyse ne sert que pour un seul horaire.
Nous ne disposons pour le moment que de deux individus par horaire et de quelques coupes par individus, ce qui ne permet pas d’étudier rigoureusement la normalité des populations. Signalons toutefois que l’ANOVA, comme la plupart des tests statistiques classiques, est considérée comme robuste par rapport à la contrainte de normalité (Scherrer, 1984).
Il convient de tenir compte de la nature particulière de la variable étudiée, à savoir une fréquence comprise entre 0 et 1 (rapport surface marquée anti-sens/surface totale de la coupe). Ce type de variable est souvent assorti d’effets de " queue ", autrement dit la répartition n’est plus gaussienne, les fréquences faibles (proches de 0%) et fortes (proches de 100%) étant généralement sous-représentées. Ceci a des incidences sur la normalité des populations et sur l’égalité des variances. Dagnélie (1975) préconise un changement de variable ou transformation pour contourner la difficulté, la transformation la plus appropriée étant la fonction arcsinus ou arccosinus.
La vérification de la condition d’égalité des variances ou condition d’homoscédasticité est impérative, le non-respect pouvant affecter fortement les résultats du test (Scheffé, 1959). Aussi nous nous attacherons à vérifier cette hypothèse et nous effectuerons le cas échéant une transformation de variable.
En particulier, nous avons testé différents temps et concentration de protéinase K. Nous avons également testé différents temps d’hybridation, différentes quantités de sonde (de 30 à 200pg/ml) et de formamide. Concernant les étapes post hybridation, nous avons optimisé le nombre, la durée et la température des lavages pour améliorer le rapport signal spécifique sur signal non spécifique. Nous avons aussi cherché à limiter le bruit de fond par l’élimination des péroxydases et des biotines endogènes. Seule l’inhibition des péroxydases diminue significativement le bruit de fond.
En définitive, les modifications apportées au protocole initial ont permis de dégager un signal avec la sonde polydT et la sonde anti-sens.
Figure 9 : Intensité du marquage tout au long de l’organe
Le marquage obtenu avec la sonde sens (b) est supérieur au témoin (c). Ceci indique la présence d’un signal non spécifique. Toutefois, le signal anti-sens (a) est plus important que le signal sens. Autrement dit, la coupe traitée anti-sens ne contient pas que du signal non spécifique. Si on compare ce dernier résultat avec la sonde polydT (d), qui rappelons-le, s’hybride avec tous les ARNm, une nette différence en faveur du marquage polydT apparaît. Ceci va dans le sens d’un marquage spécifique des ARNm par la sonde anti-sens.
Figure 10 : Marquage obtenu avec la sonde anti-sens (a), la sonde sens (b), le témoin (sans sonde, c) et le polydT (d).
Tableau II : Test t apparié pour l’horaire 6h : X : Sm/St anti-sens, Y : Sm/St sens
DDL | Moy. X-Y | T apparié | Prob. (bilatéral) |
3 | 0.231 | 2.615 | 0.0795 |
Au seuil a=0.05, ce résultats est à la limite de la significativité.
Tableau III : Test t apparié pour l’horaire 10h : X : Sm/St anti-sens, Y : Sm/St sens
DDL | Moy. X-Y | T apparié | Prob. (bilatéral) |
13 | 0.158 | 4.335 | 0.0008 |
Au seuil a =0.05, ce résultat (a >0.0008) montre une différence significative.
Tableau IV : Test t apparié pour l’horaire 22h : X : Sm/St anti-sens, Y : Sm/St sens
DDL | Moy. X-Y | T apparié | Prob. (bilatéral) |
8 | 0.051 | 2.301 | 0.00504 |
Au seuil a=0.05, ce résultat (a >0.00504) montre une différence significative.
En résumé, le signal anti-sens est significativement différent du signal sens pour les horaires 10h et 22h, il est à la limite de la significativité (a =5%) pour l’horaire 6h. On peut accorder dans ces conditions une certaine validité au signal anti-sens, autrement dit qu’il y a des ARNm de type mt1 sur les coupes analysées.
Figure 11 : Localisation du marquage dans l’hypophyse
Figure 12 : Marquage sens sur trois individus.
Tableau V : statistiques descriptives
Horaire | Effectif | Moyenne | Ecart-type | Variance |
6h | 4 | 0.185 | 0.032 | 0.001 |
10h | 14 | 0.197 | 0.068 | 0.004 |
22h | 9 | 0.174 | 0.048 | 0.002 |
La condition majeure d’application du test étant vérifiée, nous réalisons l’analyse de variance à un facteur. Les résultats sont présentés dans le tableau VI
Rappelons que les hypothèses du test sont :
Tableau VI : Table d’ANOVA à un facteur de Sm/St , X : horaire, Y : Sm/St sens,
Source | DDL | S. des carrés | Carré moyen | Test F |
Entre groupes | 2 | 0.003 | 0.002 | 0.463 |
Intra-groupes | 25 | 0.085 | 0.003 | P=0.6344 |
Total | 27 | 0.088 |
Si on fixe alpha à 5%, on ne rejette pas l’hypothèse nulle (a <0.63).
Les effectifs inégaux peuvent perturber le résultat du test. Aussi pour plus de sécurité, nous avons réalisé un test non paramétrique de Kruskal-Wallis. Ce dernier va dans le même sens (non significativité, tableau VII)
Tableau VII : résultats du test de Kruskal-Wallis
DDL | 2 |
Nombre de groupes | 3 |
Nombres de cas | 28 |
H | 1.413 p=0.4934 |
H corrigé pour les ex aequo | 1.414 p=0.4931 |
Nombre d’ex aequo | 3 |
Les analyses effectuées
vont dans le sens d’un niveau constant pour le signal sens ce qui permettra
de le négliger pour l’étude temporelle.
Tableau VIII : données brutes
Facteur jour/nuit | Horaire | Individu | Moyenne Sm/St |
N | 6h | 1/td> | 0,41625 |
2 | 0,3345 | ||
J | 10h | 1 | 0,364 |
2 | 0,35542857 | ||
J | 18h | 1 | 0,091 |
2 | 0,34 | ||
N | 22h | 1 | 0,2192 |
2 | 0,41625 |
La représentation graphique des résultats (figure 13) met en évidence des variations de la quantité d'ARNm mt1 au cours d'un nycthémère. Plus précisément, la valeur maximale est observée à 6h et la minimale à 22h.
Figure 13 : Représentation graphique des variations des ARNm au cours du nycthémère.
Tableau IX : Statistiques descriptives
Horaire | Effectif | Moyenne | Ecart-type | Variance |
6h | 8 | 0.375 | 0.152 | 0.023 |
10h | 21 | 0.358 | 0.144 | 0.021 |
18h | 10 | 0.290 | 0.120 | 0.014 |
22h | 10 | 0.222 | 0.063 | 0.004 |
Les rapports de variance sont tous inférieurs à 6, on peut donc considérer que la condition d’homoscédasticité est réalisé. Nous effectuons alors l’ANOVA
Les hypothèses sont alors :
Tableau X : ANOVA à un facteur X : Horaire, Y : Sm/St anti-sens.
Source | DDL | S. des carrés | Carré moyen | Test F |
Entre groupes | 3 | 0.159 | 0.053 | 3.206 |
Intra-groupes | 45 | 0.745 | 0.017 | p=0.0319 |
Total | 48 | 0.904 |
Si on fixe a à 5%, on rejette l’hypothèse nulle. Donc au moins deux moyennes diffèrent. Des comparaisons deux à deux sont effectuées avec le test de Fisher.
Les résultats sont regroupés dans le tableau XI suivant
Tableau XI : Résultats des tests de Fisher.
6 | 10 | 18 | 22 | |
6 | ||||
10 | ||||
18 | ||||
22 | * | * |
Il y a donc une différence entre l'horaire 22h et les horaires 6h et 10h. En revanche en ce qui concerne les autres comparaisons, on ne peut conclure.
Pour étudier l’effet jour/nuit on effectue un test t de Student en prenant 22h et 6h pour nuit et 10 et 18h pour jour.
Rappelons les hypothèses :
Condition d’application (robustesse par rapport à la normalité)
Tableau XII : Test t, X : jour/nuit, Y : Sm/St anti-sens.
Source | DDL | S. des carrés | Carré moyen | Test F |
Entre groupes | 1 | 0.024 | 0.024 | 1.278 |
Intra-groupes | 47 | 0.88 | 0.019 | p=0.2639 |
Total | 48 | 0.904 |
L'analyse statistique (au seuil a =0.05) ne montre pas de différence significative entre le jour et la nuit (figure 14).
Figure 14 : Différences Jour/Nuit du marquage.
C’est pourquoi afin de localiser les récepteurs, nous avons utilisé une technique qui préserve mieux les structures (notamment grâce à la fixation avec le paraformaldéhyde 4%). La technique d’hybridation in situ localise indirectement les récepteurs (on suppose que les messagers sont traduits) et permet de travailler sur l’expression du gène mt1.
Le signal obtenu avec la sonde anti-sens est en faveur de la présence de récepteurs à mélatonine de type mt1 dans l'hypophyse. Ces résultats vont dans le sens de ceux obtenus par Mazurais (2000), Iigot et al. (1994) et Gaildrat et Falcon (2000) chez la truite, le poisson rouge et le brochet. Chez la truite, les expériences d'hybridation in situ réalisées par Mazurais (2000) révèlent un signal spécifique faible. Notre étude corrobore ces résultats.
La faiblesse du signal peut aussi provenir d'un manque d'optimisation de la technique. Dans notre cas, la température d'hybridation utilisée favorise les liaisons spécifiques mais aussi les non spécifiques, ce qui engendre un bruit de fond important. Ce dernier entraîne une difficulté de traitement par l'analyse d'image, qu'il est intéressant de lever.
Il est nécessaire de confirmer ces résultats à l'aide d'une technique plus sensible. Celle-ci fait appel après extraction des ARNm à une amplification par RT-PCR (Reverse transcriptase – Polymerase Chain Reaction) puis par utilisation de la technique de Southern blot avec notre sonde anti-sens biotinylée. Une autre voie de confirmation est envisagée. Elle nécessite le clonage du récepteur à mélatonine du black-bass qui permettra la fabrication d'une sonde spécifique à cette espèce. Cette sonde sera alors utilisée en hybridation in situ pour la localisation et en électrophorèse pour la quantification des récepteurs mt1.
Dans la littérature, il est reconnu que la mélatonine agit sur certaines sécrétions hypophysaires via des facteurs hypothalamiques tels que le GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone), le TRH (Thyrotropin Releasing Hormon) ou la GRF (Growth Hormon Releasing Factor). La présence de récepteurs à mélatonine dans l'hypophyse suggère un mode d'action directe de la mélatonine sur cet organe. Cette voie de régulation décrite chez les Mammifères est assez nouvelle chez les Poissons. Ce résultat ouvre des perspectives originales pour l'étude de la régulation de la croissance et/ou de la reproduction. Il reste à préciser sur quels types cellulaires hypophysaires se trouvent les récepteurs mt1. Notre travail ne répond qu'en partie à cette question. Il montre que seules les cellules de l'adénohypophyse sont marquées. Les cellules sécrétrices de l'adénohypophyse diffèrent par leur sécrétion. Ces dernières peuvent être caractérisées par des anti-corps spécifiques. Nous envisageons un double marquage pour mettre en évidence simultanément les messagers mt1 et la ou les hormones sécrétées.
Outre la mise en évidence de récepteurs à mélatonine dans l’hypophyse, l’étude de la variation du nombre de récepteurs a été réalisée. Le maximum de marquage est observé à 6h et le minimum à 22h. Chez le rat, Gauer et al. (1993) note une densité de récepteur 50 à 70% plus forte au crépuscule qu'à l'aube. Ceci est à l'opposé de nos observations, où on observe un marquage 77% plus fort en début qu'en fin de jour. Cependant, rappelons que le rat un animal nocturne alors que le black-bass est diurne.
Ce type de résultat chez le poisson n'a pas encore été noté dans la littérature. Toutefois, cette première approche doit être confirmée en incluant dans l’analyse les deux horaires 2h et 14h. L’utilisation de deux réplicats supplémentaires pourra améliorer la précision des résultats.
Si la variation temporelle des récepteurs se confirme, il y aurait décalage de phase entre le pic nocturne de mélatonine circulante donné dans la littérature et le pic de récepteurs. Des résultats similaires sont retrouvés chez le mouton et le hamster ou le rythme observé dans la pars tuberalis semble inversement corrélé à la forte concentration de mélatonine plasmatique nocturne (Piketty et Pelletier, 1993 ; Gauer et al., 1993). L’étude de la variation des ARNm pourra être complétée par des analyses quantitatives plus fines type RT-PCR quantitative. Moins contraignantes que l’hybridation in situ qui reste une analyse semi-quantitative, ces méthodes permettront de traiter plus d’individus et plus de points horaires et ainsi d’améliorer la précision des résultats. Une étude en condition de luminosité constante (LL ou DD) permettra d’envisager l’endogénéité des rythmes.
La perspective de l’étude dans laquelle s’inscrit ce travail est de mieux appréhender les mécanismes d’intégration du message photopériodique par l’axe hypothalamo-hypophysaire chez diverses espèces de poisson d’intérêt économique (la truite, le black-bass et le bar). Ces espèces sont sensibles aux manipulations photopériodiques (photopériode artificielle) tant pour l’étude de la croissance que pour les comportements de prise alimentaire (Petit, 2001). A long terme, ces études visent par une meilleure connaissance du mode d’action de l’axe hypothalamo-hypophysaire à améliorer l’efficacité des élevages piscicoles.
Facteur jour/nuit | horaire | Coupe | Sm/St |
N | 6h | 1 | 0,181 |
2 | 0,155 | ||
3 | 0,231 | ||
4 | 0,175 | ||
J | 10h | 1 | 0,218 |
2 | 0,292 | ||
3 | 0,275 | ||
4 | 0,203 | ||
5 | 0,158 | ||
6 | 0,1 | ||
7 | 0,203 | ||
8 | 0,248 | ||
9 | 0,272 | ||
10 | 0,231 | ||
11 | 0,224 | ||
12 | 0,115 | ||
13 | 0,141 | ||
14 | 0,077 | ||
N | 22h | 1 | 0,2 |
2 | 0,189 | ||
3 | 0,235 | ||
4 | 0,2 | ||
5 | 0,211 | ||
6 | 0,148 | ||
7 | 0,163 | ||
8 | 0,202 | ||
9 | 0,089 | ||
10 | 0,101 |
Facteur jour/nuit | Horaire | Individu | Sm/St |
N | 6h | 1 | 0,255 |
0,471 | |||
0,669 | |||
0,27 | |||
2 | 0,263 | ||
0,331 | |||
0,258 | |||
0,486 | |||
J | 10h | 1 | 0,225 |
0,536 | |||
0,476 | |||
0,351 | |||
0,23 | |||
0,41 | |||
0,32 | |||
2 | 0,299 | ||
0,466 | |||
0,502 | |||
0,487 | |||
0,568 | |||
0,251 | |||
0,221 | |||
0,523 | |||
0,291 | |||
0,574 | |||
0,238 | |||
0,312 | |||
0,13 | |||
0,114 | |||
18h | 1 | 0,057 | |
0,125 | |||
2 | 0,419 | ||
0,417 | |||
0,308 | |||
0,234 | |||
0,365 | |||
0,352 | |||
0,281 | |||
0,344 | |||
N | 22h | 1 | 0,225 |
0,2 | |||
0,237 | |||
0,273 | |||
0,161 | |||
2 | 0,25 | ||
0,224 | |||
0,325 | |||
0,238 | |||
0,093 |
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Dernière modification : 08 Avril 2009